İnsan iPS hücresinden türetilmiş kardiyomiyositleri için düşük yapışmalı kültür seçimi

Reaktifler

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin tedarikçileri ve katalog numaraları Ek Tabloda mevcuttur. S1 çevrimiçi.

Hücre kültürü ortamı

Kardiyomiyosit seçimi için serumsuz ortam, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamına (DMEM) %0,01 askorbik asit fosfat magnezyum tuzu n-hidrat ve %1 penisilin-streptomisin çözeltisi eklenerek hazırlandı. Glikoz içermeyen kültür ortamı, 4 mM sodyum eklenerek hazırlandı. ben-laktat, %0,01 askorbik asit fosfat magnezyum tuzu n-hidrat ve glukozsuz DMEM’e %1 penisilin-streptomisin çözeltisi.

Hücrelerin hazırlanması

Kardiyomiyositler, daha önce bildirilen bir yöntem kullanılarak RIKEN’den (Tsukuba, Japonya) elde edilen hiPSC hattı 201B7’den türetildi.22,27. Başlangıçta, hiPSC’ler a-miyozin ağır zincir promotörünün kontrolü altında puromisin direnç genini eksprese edecek şekilde genetik olarak modifiye edildi ve böylece puromisin kullanılarak kardiyomiyositlerin daha sonra seçilmesi sağlandı. HiPSC’ler, mitomisin C ile tedavi edilen fare embriyonik fibroblastlarının besleyici katmanı üzerinde kültürlendi. Belirlenmiş bir askıya alınmış toplama kültürü cihazı kullanılarak kardiyomiyositlere farklılaşma sağlandı. Farklılaşma kültürünün sonunda hücreler 1×106 yoğunlukta ekildi.7 %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş DMEM içeren 100 mm doku kültürü kaplarındaki hücre/kap. Hücreler, %5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C’lik bir inkübatörde inkübe edildi.2.

Kardiyomiyosit seçimi

Doku kültürü kaplarındaki farklılaşmış hücreler, Tripsin-EDTA (37 ° C, 10 dakika) kullanılarak toplandı, üç kez serumsuz DMEM ile yıkandı ve daha sonra 3 x 106 yoğunlukta 100 mm doku kültürü kaplarına kaplandı.6 1 × 10’a kadar7 hücreler/tabak. Kardiyomiyositler üç ana teknikle tedavi edildi. İlk teknik, ya BSA ve yüksek molekül ağırlıklı DS (BSA/DS kültürü) ile desteklenmiş ortam kullanılarak ya da ticari olarak temin edilebilen düşük hücre bağlanma kapları (Corning Inc., C/N #3262) kullanılarak hücre bağlanmasını kontrol etmeyi içeriyordu. İkinci teknikte laktat takviyeli glikoz içermeyen ortamla glikoz içermeyen kültür kullanıldı. Üçüncü teknik, daha önce bahsedilen genetik olarak dahil edilmiş puromisin direnç genini kullanarak puromisin tedavisini içeriyordu. Puromisin tedavisi için, hasattan 24 saat önce ortama 1,5 μg/mL puromisin dihidroklorür ilave edildi. Seçim süreci boyunca, geçiş haricinde ortam değiştirilmedi.

Hücre sayımı ve akış sitometrisi

Hücre sayılarını ve kardiyomiyosit saflıklarını belirlemek için, yüzen, bağlı olmayan hücreler de dahil olmak üzere hücreler, Tripsin-EDTA (37 ° C, 10 dakika) kullanılarak toplandı. Hücre sayımı, ölü hücreleri dışlamak için Trypan Blue boyası içeren tek kullanımlık bir hücre sayacı (Waken B Tech, Kyoto, Japonya) kullanılarak yapıldı. Hesaplanan hücre sayılarına göre 5 × 106 örnek5 Akış sitometri analizi için hücreler veya daha azı toplandı. Gerekirse kalan hücreler, serumsuz DMEM ile üç yıkamanın ardından yeni tabaklara yerleştirildi. Örneklenen hücreler, üreticinin talimatlarına göre (1 mL’de 1 μL, 30 dakika, RT) LIVE/DEAD sabitlenebilir yeşil ölü hücre boyama kitiyle hemen boyandı. Daha sonra hücreler santrifüjlendi, %1 paraformaldehit solüsyonunda yeniden süspanse edildi ve 4°C’de saklandı. 30 dakika veya daha uzun bir süre sonra hücreler santrifüjlendi ve %0,1 Triton X-100, %5 bloke edici bir çözelti ve anti-cTnT antikorunun 1/200 seyreltisini içeren fosfat tamponlu salinde (PBS) yeniden süspanse edildi. 30 dakika sonra hücreler santrifüjlendi ve %0,1 Triton X-100, %5 bloke edici bir çözelti, Alexa Fluor 647 anti-fare IgG’nin 1/200 seyreltisi ve 2,5 μg/mL 4ʹ,6-diamidino içeren PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. -2-fenilindol (DAPI). Başka bir 30 dakikanın ardından hücreler santrifüjlendi ve PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Hücre süspansiyonu numuneleri bir Gallios akış sitometresi (Beckman Coulter yaşam bilimleri) kullanılarak analiz edildi. Canlı hücre popülasyonu, DAPI’nin floresansı ve LIVE/DEAD sabitlenebilir yeşil ölü hücre leke kiti kullanılarak geçitlendi. cTnT-pozitif hücrelerin oranı, düşük yoğunluklu tepe konumu ile yüksek yoğunluklu tepe konumu arasındaki geometrik ortalamaya ayarlanan floresan yoğunluk eşiği kullanılarak belirlendi.

Kardiyomiyosit seçim verimliliğinin analizi

Göreceli hücre numarası, RHer seçim prosedürü için plakalanan ve toplanan hücre sayısı karşılaştırılarak belirlendi. Tekrarlanan prosedürler (geçişleme gibi) için birikmiş nispi hücre sayısı, R Her adımın değerleri. Kardiyomiyosit saflığı, Abir hücre süspansiyonu örneğinde yukarıda açıklandığı gibi akış sitometrisi kullanılarak belirlendi.

İmmünfloresan

Substratlardaki hücreler, paraformaldehid sulu çözeltisi kullanılarak sabitlendi. PBS ile durulandıktan sonra hücreler, insan cTnT’sine yönelik bir fare monoklonal antikoru ile işleme tabi tutuldu. Daha sonra, Alexa Fluor 647 anti-fare IgG sekonder antikoru, Alexa Fluor 568 konjuge phalloidin ve DAPI ile tedavi edildiler.

Dayak oranlarının ölçülmesi

Hücreler, 1 x 106’da bir EZ-BindShut SP yapışkan olmayan U tabanlı 96 oyuklu plakanın (AGC Techno Glass) beş oyuğuna ekildi.4 serumsuz ortamda hücreler/oyuk. 5 veya 6 gün sonra, 100 nM izoproterenolün uygulanmasından hem önce hem de 30 dakika sonra mikroskobik videolar (> 30 saniye) yakalandı. Çekilen videolardan dayak oranları ölçüldü.

Gen ekspresyonu analizi

Hücreler, tedavi streslerinin iyileşmesini sağlamak için 5 gün boyunca serumsuz ortam içeren 3.5 cm’lik bir doku kültürü tabağında kültürlendi. Üreticinin talimatlarına göre RNeasy plus mini kiti (Qiagen) kullanılarak toplam RNA ekstre edildi. cDNA, bir RT-RamDA cDNA sentez kiti (Toyobo) kullanılarak RNA’dan sentezlendi. Daha sonra gen ekspresyonu, bir ViiA 7 gerçek zamanlı PCR sistemi (Thermo Fisher Scientific) üzerinde TaqMan RT-PCR tahlili yoluyla analiz edildi. Hedef genler için TaqMan probları Ek Tabloda bulunabilir. S2 çevrimiçi. Her genin ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması için – ΔCt’yi Ct olarak hesapladık.referans–Ctgoi Ct neredereferans referans geninin (GAPDH) ve Ct’nin Ct değeridirgoi ilgilenilen genin Ct değeridir. Daha yüksek – ΔCt ilgilenilen genin daha yüksek ifadesini gösterir. Ek olarak, kardiyomiyosite özgü üç gen çiftinin (RYR2/TNNT2, MYL2/MYL7 ve MYH7/MYL6) -ΔCt’sini hesapladık. Bu durumda eğik çizgiden sonraki gen referans gendir.

istatistiksel analiz

İstatistiksel analiz eşleştirilmiş Öğrenci kullanılarak yapıldı. T-test, iki yönlü ANOVA, Dunnett testi veya Greenhouse-Geisser düzeltmeli tek yönlü ANOVA. Sonuçlar her şekilde sunulmaktadır.

Kaynak